|
Notes:
|
Curs 2014-2015
El càncer de mama és el segon més comú en la població mundial, però els
tractaments quimioterapèutics actuals han mostrat reaccions adverses i fenòmens de
multiresistència, essent aquest últim principalment degut a l’existència d’una població
de Cancer Stem Cells (CSCs). Per tant, l’objectiu d’aquest projecte ha estat testar un
inhibidor especific (siRNA) del gen ALOX5 per veure l’efecte que té en les CSCs. Per
tal d’obtenir candidats adequats, es va utilitzar high-throughput screening comparant
CSC amb no-CSC. Diversos candidats van ser escollits per a ser validats per PCR
quantitativa, dels quals l’araquidonat 5-lipoxigenasa (ALOX5) va ser escollit com la
diana més prometedora per a dissenyar una teràpia contra les CSCs.
El mètode utiltizat per identificar les CSCs es mitjançant la separació cel·lular per un
reporter gene (tdTomato) sota l’expressió d’un marcador establert de CSCs.
D’aquesta manera es podia evaluar si després dels tractaments hi havia canvis
significatius en el percentatge de CSCs. Un dels punts de partida va ser testar un
quimioterapèutic com el paclitaxel (PTX) per veure l’efecte que produïa en les CSCs.
Seguidament es va testar l’efecte combinat del paclitaxel amb el siRNA del gen ALOX5
comprovant els percentages de CSCs al final de l’experiment. L’assaig de mamosferes
permet testar si el silenciament té un efecte sobre la supervivència de les CSCs.
També es va testar l’eficiència d’internalització de les nanoparticles per mitjà del
microscòpi confocal.
Els resultats d’aquest treball mostren com els tractaments de quimioteràpia
convencionals tenen un efecte en les non-CSCs però no en les CSC. Després de
tractar les cèl·lules de càncer de mama amb paclitaxel sempre hi ha un augment
relatiu del percentatge de CSCs. L’experiment que combina el PTX amb el siALOX5
mostra que, la presència del siRNA evita l’augment relatiu del nombre de CSCs
observat quan només hi ha l’efecte del PTX. Un cop normalitzats els replicats, no hi
ha diferències significatives entre els percentatges de CSCs. No és pot descartar
ALOX5 com a diana per les CSCs en l’assaig de mamosferes el silenciament d’aquest
gen té un efecte en la supervivència de les CSCs en dues línes de càncer de mama.
L’assaig d’internalització de les nanoparticles mostra un alta eficència d’internalització
al citoplasma, però també hi ha agreggació en els lisosomes. Aquesta agregació és un
problema atès que les condicions d’aquest orgànul poden degradar el siRNA.
Breast cancer is the second most common cancer in the overall world population, but
its actual chemotherapeutic treatment has shown adverse effects and multi-resistance
phenomena, being this last due mainly to the existence of a Cancer Stem Cells (CSC)
population within the tumor. Thus, the aim of this project has been to test an ALOX5
inhibitor to test the impact on CSCs behaviour, as well as the internalitzation of a
potencial nanocarriers for drug delivery, Several candidates were chosen to be
validated through quantitative PCR, from which arachidonate 5-lypoxigenase (ALOX5)
was chosen as the most promising candidate to target CSC.
The methodology used to identify CSCs is based on the detection of a reporter gene
(tdTomato) under the expression of a well-established CSC promotor, by cell sorting.
This model allows to detect changes in CSCs percentatge. The first step was to test
quimiotherapeutic agent (paclitaxel) in order to determine the effect in CSCs
population. The second step was to design an experiment that combines paclitaxel and
siALOX5 at different point times and analyze the CSCs percentatge. Mammospehere
assay was another experiment to check survival of CSCs. To design a new specific
nanomedicine with an inhibitor of ALOX5 Internalitzation assays with nanoparticles was
carry on to monotorize the ubication of it.
The results showed that conventional therapeutic agents did not affect CSCs
population but it affects non-CSCs. According to this result, paclitaxel is a good choice
to reduce bulk tumor. After treating cells with paclitaxel the percentatge there is a
relative increase of CSCs, this is because paclitaxel only affects non-CSCs. The results
from assay that combines PTX and siALOX5 showed that the presence of siALOX5
impairs the relative increased observed only with PTX. Normalized data did not show
significant differences between siC and untreated samples but this results are not
enough descart ALOX5 as a CSCs target because mammospehre assay showed that
silencing of ALOX5 have an effect on CSCs survival in a two diferent breast cancer cell
lines. Internalitzation assays of nanoparticles showed high internalitzation efficency in
citoplasm, as well as an aggregation in lisosomes. This aggregation is a probem
because siRNA is degradate due tu de conditions of lisosomes, such us acid pH. |
