|
Título:
|
Estudis funcionals i de plegament dels dominis d'activació de les procarboxipeptidases
|
|
Autor/a:
|
Villegas Hernández, Virtudes
|
|
Otros autores:
|
Agència de Gestió d'Ajuts Universitaris i de Recerca |
|
Resum:
|
Els dominis d’activació (ADs) de les procarboxipeptidases de la subfamília A/B sempre han sorprès ja que representen una quarta part del proenzim. S’han realitzat alguns estudis per intentar descobrir-ne alguna possible funció alternativa, però no han estat fructífers. El descobriment de l’elevada velocitat de plegament del domini d’activació de la procarboxipeptidasa A2 humana, (ADA2h), emperò, va portar a proposar la possibilitat de que realitzessin una funció d’assistència al plegament del domini enzimàtic. Posteriorment, l’anàlisi del plegament d’ADA2h a pH baix va revelar la capacitat d’aquest domini per formar fibres amiloides, a més de demostrar que un increment de l’estabilitat proteica podia prevenir la formació d’aquests agregats. La profunda caracterització del plegament d’ADA2h va fer que aquesta proteïna fos un bon model amiloidogènic, de manera que es van proposar un seguit d’experiments que s’han desenvolupat en el present treball per tal de conèixer millor aquest procés. S’han dut a terme estudis cinètics d’agregació per tal de valorar la contribució dels diferents aminoàcids de la seqüència polipeptídica, utilitzant 29 variants puntuals d’ADA2h. Es va eliminar la contribució de l’estabilitat mitjançant la utilització d’urea, i per dicroïsme circular conjuntament amb un aparell de flux detingut, es van obtenir dues velocitats diferents, v1 i v2, que corresponen a la formació d’un intermediari i a la seva reorganització, respectivament. Experiments complementaris utilitzant espectroscòpia d’infraroig (IR) revelaren la reorganització de l’estat natiu (en aquest cas) per a donar la forma agregada. Les cinètiques d’IR van mostrar que ADA2h forma l’estructura _ típica de les fibres amiloides, previ desplegament les seves hèlixs-_. Finalment, s’han realitzat estudis de biocomputació per tal d’esbrinar possibles funcions alternatives dels ADs. Les superposicions estructurals semblen mostrar similaritat dels ADs amb dominis de reconeixement d’RNA (RRM). Aquesta hipòtesi s’ha comprovat experimentalment amb ADA4h, mostrant una dèbil, però existent, unió a RNA. |
|
Resum:
|
The activation domains (ADs) of the A/B subfamily procarboxypeptidases have always surprised investigators because they represent one fourth of the entire proenzyme. Some estudies regarding possible alternative functions have been carried out with little success. Only with the discovery of the fast folding kinetics at neutral pH of the activation domain of human procarboxypeptidase A2 (ADA2h), a plausible hypothesis could be proposed, in which the AD would assist the folding of the entire proenzyme. Later on, the analysis of the folding pathway of ADA2h at low pH revealed the capability of this domain to form amyloid-like fibrils, besides proving that increased protein stability prevented the formation of those aggregates. The large background knowledge surrounding ADA2h made that protein a good candidate to be used as an amyloidogenic model, and some experiments were designed and performed in the present work in order to further examine the aggregation process. Aggregation kinetics experiments have been carried out in order to assess the different contributions of the distinct amino acids in the polypeptide sequence, using 29 single-residue variants of ADA2h. Using urea to denature all mutants to the same extent, thus eliminating stability contribution, two different rate constants were obtained with stopped-flow circular dichroism spectroscopy (CD), v1 and v2. The two constants accounted for intermediate formation (v1) and intermediate reorganization (v2). Complementary experiments using infrarred spectroscopy (IR) have revealed the reorganization of the native state (in this case) into the aggregated form. The IR kinetics showed that at first, ADA2h needs to unfold its _-helices in order to gain the _-structure typical of amyloid fibrils. Finally, biocomputing tests have been performed to discover another possible function of the ADs. Structural superpositions revealed similarity of the ADs with RNA recognition motifs (RRM), and ADA4h was tested for RNA-binding ability with success. |
|
Fecha de creación:
|
06-06-2008 |
|
Materias (CDU):
|
577 - Bioquímica. Biologia molecular. Biofísica |
|
Materia(s):
|
Procarboxipeptidases |
|
Derechos:
|
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús de Creative Commons, amb la qual es permet copiar, distribuir i comunicar públicament l'obra sempre que se'n citin l'autor original i l’Agència i no se'n faci cap ús comercial ni obra derivada, tal com queda estipulat en la llicència d'ús (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/es/) |
|
Páginas:
|
8 p. |
|
Tipo de documento:
|
Informe |
|
Collection:
|
Els ajuts de l'AGAUR;2003FI00388
|
|
Compartir:
|
|
