MEMORIA
FINAL DEL PROYECTO INIA SC97-131-C2-2,
“ETIOLOGÍA
DE ENFERMEDADES ASOCIADAS AL DECAIMIENTO DEL PERAL. MEJORA DE TÉCNICAS DE
DETECCIÓN DE FITOPLASMAS”
Índice
1.-Introducción
2.-Planteamiento y desarrollo de
las actividades realizadas
3.-Grado de consecución de los
objetivos
4.-Conclusiones y resultados
alcanzados
5.-Aplicación al sector y posible
difusión de resultados
6.-Colaboraciones y ayudas
recibidas o prestadas
7.-Vinculación del proyecto a
programas de cooperación científica y técnica internacional; entidades
extranjeras con las que se ha cooperado: financiación y cuantía, en su caso, y
utilización de resultados alcanzados.
1.-INTRODUCCIÓN
El
fitoplasma causante de la enfermedad del decaimiento del peral o Pear decline (PD) había sido descrito en
nuestro país, pero se desconocía la incidencia real del patógeno, ya que las
sintomatologías observadas se confundían a menudo con otros patógenos o con
posibles desordenes fisiológicos. Se propuso realizar un estudio conducente a
discernir la presencia del PD de
otros agentes afines, así como determinar su incidencia y distribución por
variedades y patrones en el área frutícola de Cataluña y Cuenca del Ebro. Así
mismo, para un adecuado control de la enfermedad era necesario conocer cuales
eran las especies de insectos vectores de la enfermedad en la zona y conocer si
existía un único aislado del fitoplasma o por el contrario existía variabilidad
genética del mismo. Se desconocía si la distinta expresión de síntomas
observada era debida a variabilidad genética del fitoplasma o a una respuesta
varietal. En el momento de iniciarse el proyecto únicamente dos especies del
género Cacopsylla habían sido identificadas como vectores de la
enfermedad C. pyricola y C. pyrisuga, aunque se sospechaba que C.
pyri también era probablemente vector de la enfermedad, ya que era la
especie más abundante en los países mediterráneos y se habían identificado
individuos de esta especie portadores del fitoplasma. Por otro lado, la
dificultad de diagnosticar las enfermedades producidas por fitoplasmas era
también uno de los principales problemas para su control. La técnica de la PCR
aunque era la más sensible, resultaba poco asequible para la aplicación
rutinaria en empresas o para la certificación de material vegetal. Los
principales problemas eran debidos a la complejidad del proceso de extracción
del ADN, especialmente en leñosas y muy especialmente en peral, donde la
presencia de inhibidores interfiere a menudo en el desarrollo de la PCR. Por
estos motivos se planteó la mejora de las técnicas de detección para este
fitoplasma y la puesta a punto de modificaciones que simplificaran la técnica
de la PCR y permitieran su utilización de forma más rutinaria. Otro punto importante
para la detección precoz de la enfermedad era conocer la distribución y
concentración del fitoplasma en los distintos estadios fenológicos del árbol y
en los distintos tejidos u órganos, con el fin de determinar el mejor momento
para realizar la detección. Otra finalidad de este objetivo era determinar en
que épocas del año podía propagarse la enfermedad a través de la multiplicación
vegetativa, ya que se creía que el fitoplasma descendía a las raíces durante el
invierno y por tanto las yemas tomadas durante este período estaban libres del
mismo. También se planteó un estudio para determinar la correlación entre la
detección del fitoplasma y la expresión de síntomas, ya que la detección del
fitoplasma en plantas asintomáticas es esencial en los procesos de propagación
vegetativa y de certificación del material vegetal obtenido.
La
expresión y gravedad de los síntomas de esta enfermedad depende en gran manera
de la susceptibilidad de la variedad y de la combinación
porta-injertos-variedad. Se conoce que la utilización en algunos países de
patrones muy sensibles como los patrones orientales, Pyrus serotinia y P.
ussuriensis introducidos por su resistencia al fuego bacteriano, hicieron
proliferar la enfermedad del Pear decline
y causar la muerte a un gran número de árboles en décadas anteriores. Así pues,
otro de los objetivos del proyecto fue el estudio en parcelas experimentales y
en parcelas comerciales del desarrollo de síntomas en distintas combinaciones
patrón-variedad.
2.-PLANTEAMIENTO Y DESARROLLO DE
LAS ACTIVIDADES REALIZADAS
Los objetivos y actividades que se propusieron en este
proyecto fueron:
1.-Epidemiología de la enfermedad causada
por Pear decline (PD)
1.1.-Prospección
para determinar la presencia e incidencia del PD en Cataluña
Actividad 1.- Observación de 1500
parcelas comerciales y valoración de la incidencia de la enfermedad en 45 parcelas afectadas mediante
observación de 500 árboles en cada una de ellas.
1.2.-Epidemiología
de la enfermedad del PD en Cataluña. Seguimiento del índice de plantas enfermas
en distintas parcelas afectadas. Identificación de vectores potenciales.
Actividad 2.- Seguimiento de la
incidencia de la enfermedad en 7 parcelas afectadas durante 4 años.
Actividad 3.- Identificación de
vectores potenciales mediante captura de insectos en tres parcelas afectadas y
análisis de la presencia del fitoplasma en las especies potencialmente
transmisoras de fitoplasmas.
2.-
Etiología de distintas sintomatologías observadas en plantaciones de peral en
el Noreste de España. Identificación de virus, fitoplasmas e identificación del
fitoplasma asociado al Pear decline (PD).
La
finalidad de este objetivo era determinar si la distinta gravedad y expresión
de síntomas observada podía ser debida a la presencia de otros agentes
infecciosos (virus u otros fitoplasmas). Para ello se realizaron dos
actividades:
Actividad
4.- Análisis serológico para determinar la presencia de Apple stem grooving
virus (ApSGV) y Apple chlorotic leaf spot virus (ApCLSV) y análisis
mediante PCR para determinar la presencia de fitoplasmas en 250 muestras de
árboles presentando síntomas de decaimiento.
Actividad
5.- Análisis para determinar la presencia de distintos virus i/o fitoplasmas
mediante indexaje en huéspedes sensibles de 30 muestras presentando distintos
síntomas de decaimiento.
3.-
Detección y caracterización molecular de la enfermedad.
3.1.- Actividad 6. Mejora de las
técnicas de detección por PCR. Valoración de la sensibilidad de distintos pares
de iniciadores universales y específicos (P1/P7, fU5/rU3, fO1/rO1, fPD/rPD,
P1/PYLR, R16(X). Metodología de la extracción del ADN . Lectura de resultados
de la amplificación por PCR.
3.3.- Actividad 7. Estudio de la
variabilidad genética del fitoplasma asociado al Pear decline .
La
finalidad de esta actividad era conocer si la distinta gravedad de síntomas de
decaimiento podía ser debida a la presencia de distintos aislados de este
fitoplasma.
3.3.1.-Puesta a punto de la técnica de la SSCP para la diferenciación de
aislados de fitoplasmas.
3.3.2.-
Estudio de la variabilidad genética del fitoplasma mediante RFLP con diferentes
enzimas de restricción.
4.-
Evaluación de material vegetal. Estudio de las relaciones huésped-patógeno.
Distribución del patógeno en el árbol. Influencia de la combinación
patrón-variedad en el desarrollo y expresión de los síntomas de la enfermedad
del Pear Decline (PD).
4.1.-Distribución del patógeno en el
árbol.
La finalidad de este objetivo fue determinar la distribución
del fitoplasma en el árbol para determinar el mejor momento para realizar la
detección y para conocer la posible transmisión del fitoplasma mediante
propagación vegetativa en cada época.
Actividad 8.- Identificación del patógeno en diferentes niveles del árbol
en las variedades Limonera y Decana del congreso.
Actividad 9.- Seguimiento de la detección a lo largo del año (junio-mayo)
en 45 árboles pertenecientes a las variedades Blanquilla,
Limonera y Barlett.
4.2.-Evaluación de la
susceptibilidad y resistencia del material vegetal. Influencia de la
combinación patrón-variedad en el desarrollo de los síntomas.
Actividad 10.- Seguimiento de la expresión de síntomas a lo largo del año
en árboles afectados de las variedades Blanquilla
injertada en peral franco, Blanquilla injertada en
membrillero, Limonera injertada en peral franco y Barlett injertada en peral franco.
Actividad 11.- Ensayo realizado con cinco patrones ( C.oblonga BA-29, C.oblonga
MA, C. oblonga Adams, Pyrus
communis y P. communis OHF-333) y cuatro
variedades (Blanquilla, Conference, Mantecosa Bosc y
Decana del congreso).
3.-GRADO DE CONSECUCIÓN DE LOS OBJETIVOS
Objetivo 1.-Epidemiología de la enfermedad causada por Pear decline
1.1.- Prospección para determinar la importancia de la enfermedad causada
por el fitoplasma asociado al Pear decline
Se realizó la prospección tal como estaba prevista en el proyecto, lo que
nos permitió conocer la incidencia de la enfermedad del decaimiento del peral o
Pear decline en Cataluña y su distribución por
variedades y patrones.
1.2.- Seguimiento del índice de plantas enfermas en distintas parcelas
afectadas. Identificación de vectores potenciales.
Se valoró el incremento de la incidencia de la enfermedad durante cuatro
años (1997-2000).
Se realizó durante dos años (1998-1999) un seguimiento de la población de
especies potencialmente transmisoras de fitoplasmas en tres parcelas afectadas
por Pear decline. Individuos de estas especies
capturados desde abril hasta octubre fueron analizados mediante PCR para
determinar la presencia del fitoplasma en ellos.
Se identificó Cacopsylla pyri como única
especie portadora del fitoplasma asociado al Pear
decline en la zona.
Objetivo 2.-Etiología de distintas sintomatologías
observadas en plantaciones de peral en el Noreste de España. Identificación de
virus y fitoplasmas en muestras con síntomas.
Este objetivo se desarrolló tal como estaba previsto en el proyecto, por
un lado 250 muestras con síntomas de decaimiento procedentes de 10 parcelas
afectadas fueron analizadas serológicamente para determinar la presencia de ApSGV y ApCLSV. Estas
mismas muestras fueron analizadas mediante PCR con iniciadores universales y
específicos para determinar la presencia de fitoplasmas. Por otro lado 3
muestras con síntomas de decaimiento de cada una de las 10 parcelas fueron
injertadas sobre huéspedes sensibles para determinar la presencia de otros virus
y enfermedades transmisibles del peral.
El fitoplasma asociado al Pear decline fue
identificado como el principal patógeno responsable de la sintomatología de
decaimiento ya que solamente en un pequeño porcentaje de las muestras analizadas
se detectó alguna de las virosis analizadas. El único fitoplasma identificado en
las muestras analizadas fue el asociado al Pear decline
perteneciente al grupo Apple proliferation. No se
identificaron fitoplasmas pertenecientes a otros grupos.
Objetivo 3.-Detección y caracterización molecular de la
enfermedad
3.1.- Valoración de la sensibilidad de distintos pares de iniciadores
universales y específicos. Mejora de las técnicas de detección del fitoplasma
asociado al PD.
Se ensayaron distintos iniciadores universales y específicos,
determinándose los que daban mejores resultados para la detección de este
fitoplasma.
Debido a que el fitoplasma asociado al Pear
decline es uno de los que se encuentra en concentraciones más bajas en el
árbol resulta difícil la simplificación de la técnica de extracción de su ADN,
sin embargo se
mejoró la extracción utilizando volúmenes pequeños de extracto, lo que
permitió procesar un mayor número de muestras que utilizando el volumen
recomendado habitualmente. Se puso a punto la técnica de la inmunocaptura para
la detección de fitoplasmas. No se obtuvieron buenos resultados para la
detección de Pear decline, posiblemente debido a la
baja concentración con que se encuentra en el árbol. Sin embargo, si se
obtuvieron buenos resultados en la detección de otros fitoplasmas como el
stolbur en Catharantus roseus, por lo que debido al
interés de esta técnica se sigue trabajando en ella para la detección del PD.
Se puso
a punto un método de lectura de resultados de la PCR alternativo a la
electroforesis.
3.2.- Estudio de la variabilidad genética del fitoplasma
asociado al PD
Se analizaron mediante RFLP, muestras de distintos orígenes geográficos
(España, Alemania) positivas para Pear decline. Los
análisis de variabilidad se realizaron exclusivamente con el fragmento de ADN
perteneciente al gen ribosómico 16S muy conservado en todos los fitoplasmas y
hasta el momento no se han determinado diferencias en estos fragmentos.
Se puso
a punto la técnica del análisis del polimorfismo conformacional del ADN
monocatenario (SSCP) para la diferenciación de aislados de fitoplasmas. Esta
técnica había sido utilizada con éxito para la diferenciación de aislados de
distintos virus pero no había sido aplicada a la diferenciación de aislados de
fitoplasmas.
Objetivo 4.- Evaluación de material vegetal. Estudio de las
relaciones huésped-patógeno. Distribución del patógeno en el árbol. Influencia
de la combinación patrón-variedad en el desarrollo y expresión de los síntomas
de la enfermedad del Pear Decline (PD).
4.1.-Distribución del patógeno en el árbol.
Se determinó la distribución y presencia del fitoplasma en al árbol a lo
largo del año. Se determinó el mejor momento para la realización del diagnostico
y el mejor órgano o tejido para realizar el análisis. Se identificó el
fitoplasma durante el invierno, lo que puso de manifiesto el peligro de propagar
la enfermedad durante este período.
4.2.-Evaluación de la susceptibilidad y resistencia del material vegetal.
Influencia de la combinación patrón-variedad en el desarrollo de los
síntomas.
Se determinó la evolución de la sintomatología en parcelas comerciales a
lo largo del año en las distintas variedades y en las distintas combinaciones
patrón-variedad. Se determinó que los síntomas son más severos en las variedades
injertadas sobre membrillero que sobre peral franco.
Los ensayos en parcelas experimentales no se pudieron iniciar el primer
año de proyecto como estaba previsto y distintos factores han hecho que no se
haya dispuesto del ensayo completo hasta el tercer año de proyecto. Actualmente
se dispone del ensayo tal como estaba previsto pero no se dispone todavía de
resultados de esta actividad.
4.-CONCLUSIONES Y RESULTADOS ALCANZADOS
Objetivo 1.-Epidemiología de la enfermedad causada por Pear decline
Actividad 1.- Valoración de la importancia del decaimiento del peral en
las áreas productivas de nuestro país.
Uno de los objetivos de este proyecto fue la realización de
una prospección en las áreas productivas de peral de Cataluña y Aragón con el
fin de conocer la importancia de la enfermedad en nuestro país. La prospección
en Cataluña se realizó con la colaboración de los técnicos de las Asociaciones
de Defensa Vegetal y consistió en la observación de más de 1500 parcelas
comerciales. Los resultados de esta prospección mostraron que alrededor del 7 %
de las parcelas observadas presentaban una incidencia de plantas enfermas
superior al 5 % y que probablemente existan más parcelas afectadas con una
incidencia menor (Tabla 1). La variedad más afectada fue la Limonera con un 15%
de las parcelas de esta variedad afectadas y la menos la variedad Blanquilla con un
1% de parcelas afectadas. Otras variedades afectadas fueron Barlett y Williams (7% de
parcelas afectadas), Conference, Ercolini y Abatte Fettel
(Tabla
1). En las distintas parcelas donde se presentaban síntomas de
decaimiento se tomaron muestras de árboles afectados y se analizaron por
PCR-nido con iniciadores universales y específicos para confirmar o descartar si
la sintomatología era debida al fitoplasma. En las parcelas donde se confirmó la
presencia del fitoplasma se determinó la incidencia de la enfermedad mediante
observación visual de 250 a 500 árboles, dependiendo del tamaño de la parcela.
Los resultados obtenidos mostraron que esta oscilaba de un 5 a un 60% de árboles
enfermos (Tabla 2). La incidencia mayor se presentaba en parcelas de la variedad
Limonera injertada tanto en C.
oblonga (32-59% de incidencia) como en P.communis
(8-58%) (Tabla 2).
Tabla 1.- Variedades de peral afectadas por Pear decline (PD) y
porcentaje de parcelas afectadas de cada una de ellas en Cataluña
Variedad |
Área Cultivada (Ha) |
Número de parcelas muestreadas1 |
Número de parcelas afectadas |
% parcelas afectadas por PD |
Limonera |
2350 |
305 |
48 |
15,73% |
Conference |
1608 |
209 |
12 |
5,78% |
Ercolini |
644 |
83 |
2 |
2,40% |
Blanquilla |
3247 |
422 |
4 |
0,94 % |
Otras2 |
3696 |
481 |
35 |
7,27% |
Total |
11.545Ha |
1500 |
101 |
6,73% |
1Las parcelas muestreadas tenían una superficie aproximada de
1 Ha
2Williams, Barlett, Devoe, Alejandrina y Moratini
Tabla 2.-Incidencia de árboles con síntomas de decaimiento en 45
parcelas afectadas y porcentaje de detección del fitoplasma por PCR-nido con los
iniciadores P1/P7 y rO1/fO1.
Variedad |
Patrón |
Número de parcelas |
Porcentaje de árboles con síntomas (%)1 |
% de muestras positivas por PCR/ total árboles con
síntomas |
Limonera |
C.oblonga |
16 |
32-59% |
60% |
Limonera |
P.communis |
12 |
8-58% |
67% |
Barlett |
C.oblonga |
2 |
12-22% |
60% |
Barlett |
P.communis |
5 |
20-32% |
75% |
Williams |
C.oblonga |
2 |
14-22% |
60% |
Williams |
P.communis |
4 |
23-29% |
65% |
Blanquilla |
C.oblonga BA29 |
4 |
5-35% |
50% |
1 Valorado en las parcelas donde se muestrearon los árboles
con síntomas
La consecución de este objetivo nos ha permitido conocer que
la enfermedad esta ampliamente distribuida tanto en la variedad Limonera, una de
las más cultivadas en la región y de la cual se están realizando nuevas
plantaciones, como en otras variedades. Por otro lado el fitoplasma también se
identificó en plantones certificados procedentes de vivero, lo que indica que
los controles realizados no son suficientes para garantizar la sanidad del
material vegetal.
1.2.-Epidemiología de la enfermedad del PD en Cataluña.
Seguimiento del índice de plantas enfermas en distintas parcelas afectadas.
Identificación de vectores potenciales.
Actividad 2.-
Seguimiento de la incidencia de la enfermedad en 7 parcelas afectadas durante 4
años.
Se realizó un estudio epidemiológico en el que se valoró el
incremento de la incidencia de la enfermedad en 7 parcelas afectadas y en el que
se realizó un seguimiento de las especies de insectos potencialmente vectores de
fitoplasmas.
El incremento de la enfermedad en estas parcelas dependió de
la variedad y de la incidencia inicial oscilando de un 13% a un 35% de
incremento para los cuatro años. El mayor incremento se produjo en las parcelas
2 y 3 correspondientes a la variedad Limonera
injertada sobre C. oblonga (BA-29 y MA
respectivamente) de entre 8 y 11 años de edad (Tablas 3 y 4).
Tabla 3.- Características de las parcelas en las que se evaluó la
evolución de la incidencia de árboles enfermos (1-7) y realizado la captura
de insectos (1, 2 y 7).
Parcela |
Variedad |
Porta injerto |
Edad (años) |
Sistema de riego |
1 |
LIMONERA |
Peral franqueado |
Arrancada |
Localizado goteo |
2 |
LIMONERA |
BA29/ intermediario |
8-9 |
Localizado goteo |
3 |
LIMONERA |
Membrillero MA |
11 |
A manta |
4 |
WILLIAMS |
Membrillero |
25 |
A manta |
5 |
BARLETT |
Peral franqueado |
14 |
Localizado goteo |
6 |
BLANQUILLA |
BA-29/ intermediario |
9 |
Localizado goteo |
7 |
LIMONERA |
Peral franqueado |
>20 |
A manta |
Tabla
4.- Incidencia de árboles con síntomas en 7 parcelas afectadas y porcentaje
de detección del fitoplasma en las muestras con síntomas
|
VARIEDAD |
INCIDENCIA %Plantas síntomas/1997 |
INCIDENCIA %Plantas síntomas /1998 |
INCIDENCIA %Plantas síntomas /1999 |
INCIDENCIA %Plantas síntomas /2000 |
Incremento 1997-2000 |
1 |
LIMONERA |
9,30% |
- |
- |
- |
- |
2 |
LIMONERA |
12.47% |
21,00% |
35% |
38% |
26% |
3 |
LIMONERA |
22.96% |
26,00% |
29,50% |
58% |
35% |
4 |
WILLIAMS |
8.33% |
18,00% |
22,00% |
25% |
16% |
5 |
BARLETT |
18.18% |
25,45% |
30,73% |
32% |
13% |
6 |
BLANQUILLA |
21.00% |
27,00% |
33,00% |
35% |
14% |
7 |
LIMONERA |
- |
37,00% |
42,00% |
50% |
13% |
Actividad 3.- Identificación de vectores potenciales
mediante captura de insectos en tres parcelas afectadas y análisis de la presencia del
fitoplasma en las especies potencialmente transmisoras de fitoplasmas.
Para establecer los insectos portadores del fitoplasma del
PD se procedió a su captura mediante trampas
amarillas adhesivas situadas a 0,5 m y a 2,5 m en tres de las parcelas en
las que se realizó el seguimiento de árboles enfermos (Figura 1). Se utilizaron
un total de 8 trampas por parcela, las cuales se remplazaron cada quince días y
los insectos, una vez clasificados, se analizaron mediante PCR para determinar
la presencia de fitoplasmas en ellos. Se analizaron las especies pertenecientes
a grupos potencialmente vectores de fitoplasmas (cicadélidos, fulgóridos y
psílidos). Las claves utilizadas para la identificación fueron las de H. Ribaut
(1952) y I. D Hodkinson & I. M. White (1979), basadas en las diferencias
morfológicas principalmente de la armadura genital de los machos. La
identificación de algunos insectos sólo se realizó a nivel de género, por
haberse capturado únicamente hembras.
En cuanto a especies portadoras de fitoplasmas se
identificaron los cicadelidos: Neoaliturus fenestratus, Psammottetix striatus y Macrosteles
sexnotatus, el fulgorido Laodelphax striatellus y el psyllido Cacopsylla pyri,
pero únicamente este ultimo fue identificado como portador del fitoplasma
asociado al Pear
decline. En las parcelas afectadas se identificaron 5 especies más del
genero Cacopsylla:
C.mali, C. melanoneura, C.pulchella, C.pyrisuga y C.saliceti, pero en
muy bajo número y no identificándose ninguna positiva hasta el momento (Tabla 5;
Figura1).
Los estudios
epidemiológicos indicaron que al igual que ocurre en otros países del área
mediterránea como Italia, probablemente C.pyri es el vector más importante en la zona, ya que
es la especie más abundante en la región, habiéndose capturado muy pocos o
ningún individuo de las otras dos especies citadas como vectores de la
enfermedad, C.pyricola y C. pyrisuga. El seguimiento de las poblaciones de
esta especie y el análisis de los individuos recolectados han señalado que los
primeros individuos infectados se presentan ya en mayo y que se presentan varios
picos de población siendo los más importantes en junio y septiembre.
Tabla 5.- Detección de fitoplasmas en las especies de insectos
capturados en
tres parcelas de peral en Lérida
ESPECIE |
Parcela
1 |
Parcela
2 |
Parcela 3 |
Detección Fitoplasmas |
Detección Pear decline |
|
|
|
|
|
|
Cicadellidae |
|
|
|
|
|
Aphrodes carinatus |
|
X |
|
- |
- |
Balclutha rosea |
X |
|
|
- |
- |
Edwardsiana rosae |
|
X |
X |
- |
- |
Empoasca decedens |
|
X |
|
- |
- |
Empoasca decipiens |
X |
X |
X |
- |
- |
Erythoroneura bisignata |
X |
|
X |
- |
- |
Erythroneura tamaricis |
X |
|
X |
- |
- |
Euscelidius variegatus |
X |
X |
|
- |
- |
Hardya tenuis |
X |
|
X |
- |
- |
Hauptidia marocanna |
|
X |
|
- |
- |
Hecalus storai |
|
X |
X |
- |
- |
Macrosteles sexnotatus |
X |
X |
X |
+ |
- |
Neoaliturus fenestratus |
|
X |
X |
+ |
- |
Neoaliturus haematoceps |
X |
X |
X |
- |
- |
Opsius stactogalus |
X |
|
X |
- |
- |
Platymetopius sp. |
X |
|
|
- |
- |
Psammotettix striatus |
X |
X |
|
+ |
- |
Typhlocyba aurovitata |
X |
|
|
- |
- |
Zyginidia scutellaris |
X |
X |
X |
- |
- |
Delphacidae |
|
|
|
|
|
Laodelphax straitells |
|
X |
X |
+ |
- |
Psylloidea |
|
|
|
|
|
Cacopsylla pyri |
X |
X |
X |
+ |
+ |
C. mali |
|
|
X |
- |
- |
C. melanoneura |
|
|
X |
- |
- |
C. pulchella |
|
|
X |
- |
- |
C. pyrisuga |
|
|
X |
- |
- |
Objetivo 2.-Etiología de distintas sintomatologías
observadas en plantaciones de peral en el Noreste de España. Identificación de
virus y fitoplasmas en muestras con síntomas.
Actividad 4.- Análisis serológico para determinar la
presencia de Apple stem grooving virus (ApSGV) y Apple chlorotic leaf spot virus (ApCLSV) y análisis
mediante PCR para determinar la presencia de fitoplasmas en 250 muestras de
árboles con síntomas de decaimiento.
Otro de los objetivos del proyecto fue determinar la etiología de la
enfermedad y determinar si la distinta expresión de síntomas (Figura 2) podía estar
condicionada por la presencia de distintos virus y de otros fitoplasmas
distintos al PD. Para ello, se escogieron 10
parcelas que presentaban síntomas de decaimiento, reducción de crecimiento
vegetativo, clorosis, necrosis, enrrollamiento y enrojecimiento de hojas. De
cada parcela se tomaron muestras de 25 árboles, las cuales fueron analizadas
mediante PCR para determinar la presencia de fitoplasmas. Estas mismas muestras,
250 en total fueron analizadas mediante ELISA para determinar la presencia de ApSGV y ApCLSV.
Ninguna muestra resultó positiva para estas virosis el primero año, mientras que
el segundo año se obtuvo una muestra positiva de ApCLSV y una de ApSGV.
El fitoplasma detectado en todas las muestras fue siempre
el asociado al Pear decline perteneciente al grupo
Apple proliferation.
Actividad 5.- Análisis para determinar la presencia de
distintos virus i/o fitoplasmas mediante indexaje en huéspedes sensibles de 30
muestras presentando distintos síntomas de decaimiento
Treinta muestras procedentes de las 10 parcelas citadas anteriormente ( 3
por parcela) fueron también analizadas mediante injerto sobre indicadores
leñosos para poner de manifiesto otras virosis u otras sintomatologías de
etiología desconocida transmisibles por injerto. Para ello se estableció una
parcela de indexaje en una finca de Gimenells (Lérida). Los indicadores
utilizados fueron Pyronia veitchii, Decana del congreso y Virginia
Crab. Para cada muestra e indicador se injertaron cinco árboles y se dejó
uno como control negativo. Para cada indicador se dispuso un bloque como control
positivo compuesto por cinco árboles injertados con una muestra positiva.
Los resultados obtenidos mostraron que únicamente un pequeño porcentaje
de las muestras analizadas presentaba alguna virosis (Figura 3) y que por tanto
el principal responsable de la sintomatología parece ser el fitoplasma, ya que
éste se detectó mediante PCR en las muestras sintomáticas en unos porcentajes
que oscilaron entre un 60 y un 80%. La mayor o menor expresión de síntomas
parece depender más de las condiciones climáticas, los años de mayor sequía se
observó un mayor porcentaje de árboles con síntomas y de la variedad o patrón
utilizado ya que los síntomas fueron más patentes en las variedades injertadas
sobre membrillero que sobre peral franco, tal como se ve en los resultados del
objetivo 4.
3.- Detección y caracterización molecular de la
enfermedad.
Actividad 6.- 3.1- Mejora de las técnicas de detección por
PCR. Valoración de la sensibilidad de distintos pares de iniciadores universales
y específicos (P1/P7, fU5/rU3, fO1/rO1, FPD/rPD, P1/PYLR, R16(X). Metodología de
la extracción del ADN . Lectura de resultados de la amplificación por PCR.
La técnica de diagnóstico empleada en todos los estudios realizados fue
la PCR, evaluándose la sensibilidad de distintos métodos de extracción del ADN y
también la sensibilidad de distintos iniciadores universales y específicos. Para
la extracción de ADN se determinó que el mayor rendimiento se obtenía cuando se
realizaba una primera fase de concentración de fitoplasmas y que la mayor
concentración de ADN se obtenía cuando la extracción se realizaba a partir de la
corteza o de yemas. Para la realización de la PCR se observó que era necesario
la realización de la PCR nido, ya que una única PCR era insuficiente para la
detección de este fitoplasma. Los iniciadores que mejores resultados dieron
fueron P1/P7, seguidos de fU5/rU3 como universales o de fO1/rO1 como específicos
(Tabla 6).
Estos últimos iniciadores
son específicos para todos los fitoplasmas del grupo Apple
proliferation y detectaron un mayor número de muestras positivas que el par
especifico para PD (fPD7/rPD). Otros pares ensayados
como los del grupo (R16) desarrollados por Lee et al. 1995, dieron peores
resultados, principalmente de especificidad.
Se realizaron ensayos de inmunocaptura para la realización
de la PCR, utilizando para ello extractos brutos del material vegetal, pero
hasta el momento no se han obtenido buenos resultados para la detección del PD, probablemente debido a la poca concentración con
que se encuentra este fitoplasma. Si que se obtuvieron buenos resultados para
la detección del fitoplasma asociado al stolbur, cuando este se encontraba en Catharantus roseus donde la concentración del
fitoplasma es elevada (Figura 6). Sin embargo debido al interés que tendría el
poder realizar la PCR directamente con extractos vegetales se prevé realizar más
ensayos en el proyecto que se ha iniciado este año.
Se desarrolló un método para la lectura de los resultados
de la PCR como alternativa a la realización de la electroforesis y a la tinción
con Bromuro de etidio. El método consistió en la utilización de iniciadores
marcados con biotina. El producto de la PCR (2 ml) fue depositado en membranas de nylon, hibridado con
streptoavidina-fosfatasa alcalina y a continuación se reveló con nitroblue de
tetrazolio.
Tabla 6.-
Identificación de fitoplasmas en muestras de peral con síntomas con iniciadores
universales y específicos.
Iniciadores |
% muestras + / muestras con síntomas |
Nested PCR (P1/P7 y U3/U5) |
67% |
fO1/rO1 |
58% |
fPD/rPD |
42% |
P1/PYLR |
42% |
Figura 6.- Detección
mediante PCR en extractos vegetales fijados mediante inmunocaptura. Filas 4,5,6,
11, 12 y 13, extractos de Catharantus roseus
infectada con stolbur. Filas 14 y 15 control positivo. Filas 10 y
19, control de peso molecular.
Actividad 7. Objetivo 3.2.- Estudio de la variabilidad
genética del fitoplasma asociado al Pear decline
El conocimiento de la posible presencia de distintos
aislados de este fitoplasma es muy importante para completar los estudios
epidemiológicos realizados. El conocimiento de cómo evoluciona el fitoplasma y
su relación con la expresión de síntomas es un parámetro a tener en cuenta para
el control de la enfermedad. Sin embargo los estudios de variabilidad genética
únicamente se han iniciado y deben continuarse con el estudio de otras zonas del
ADN del fitoplasma.
Para la caracterización de aislados se puso a punto la
técnica del análisis del polimorfismo conformacional del ADN monocatenario
(SSCP). Esta técnica había sido utilizada con éxito para la caracterización de
aislados del virus de la tristeza y para la caracterización de aislados de otros
virus y viroides, pero no había sido utilizada para la diferenciación de
aislados de fitoplasmas.
También se utilizó la digestión del producto de la PCR con distintas
enzimas de restricción, pero hasta el momento no se han encontrado diferencias
entre las muestras evaluadas hasta el momento.
Todos los estudios realizados hasta el momento, tanto de SSCP como de
RFLP se han
realizado con fragmentos de ADN pertenecientes al gen ribosómico 16S,
amplificados con iniciadores específicos. Actualmente se han iniciado estudios utilizando
otras zonas del genoma del fitoplasma.
4.- Evaluación de material vegetal. Estudio de las
relaciones huésped-patógeno. Distribución del patógeno en el árbol. Influencia
de la combinación patrón-variedad en el desarrollo y expresión de los síntomas
de la enfermedad del Pear Decline (PD).
4.1.-Distribución del patógeno en el
árbol.
La finalidad de este objetivo fue determinar la
distribución y presencia del fitoplasma en las distintas partes del árbol a lo
largo del año, con el fin de determinar la época más adecuada para realizar el
diagnóstico. Para la consecución de este objetivo se realizaron dos ensayos:
Actividad 8.- Identificación del patógeno en
diferentes niveles del árbol en las variedades Limonera
y Decana del congreso.
El
objetivo de esta actividad fue determinar la presencia del fitoplasma durante el
periodo invernal en los distintos niveles del árbol.
Para
este ensayo se escogieron siete árboles de la variedad Limonera y cinco de la variedad Decana del congreso identificados previamente como
positivos y quincenalmente de enero a abril se tomaron y analizaron muestras de
tres niveles distintos del árbol (Gráfico 1)
De
forma general, no parecen existir diferencias considerables en la detección por
niveles, si bien en el mes de marzo aumentó el porcentaje de detección en el
nivel más bajo (Gráfico 1). Por tanto la conclusión de esta actividad es que la
toma de muestras para la realización del diagnostico debe realizarse de forma
aleatoria de las distintas partes del árbol.
La localización del fitoplasma en los vasos liberianos durante el
invierno también se puso de manifiesto mediante microscopia confocal (Figura 4).
Actividad 9.- Seguimiento de la detección a lo largo del
año (junio-mayo) en 45 árboles pertenecientes a las variedades Blanquilla, Limonera y Barlett.
El estudio se realizó en 45 árboles pertenecientes a tres
variedades (Barlett, Limonera y Blanquilla). Los resultados obtenidos mostraron que el
fitoplasma se detecta desde junio hasta abril y que al contrario de lo señalado
hasta ahora por otros autores, el fitoplasma podía detectarse durante el periodo
de latencia invernal. Actualmente se está estudiando si el fitoplasma detectado
durante el invierno es viable. Para ello se injertaron patrones de membrillero
con yemas procedentes de estaquillas con resultado positivo para PD en invierno. La
persistencia durante el periodo invernal es un factor a tener en cuenta ya que
la diseminación del fitoplasma a través de los injertos de invierno puede ser
importante sino se realizan controles adecuados. Hasta ahora existía la creencia
de que mediante el injerto de yemas tomadas en invierno se evitaba la
diseminación de la enfermedad. La detección durante el periodo invernal se
realizó en las variedades Limonera, Barlett, Blanquilla, Decana de comice, Abatte
Fettel y Flor
de invierno.
Para la mayoría de variedades el porcentaje de
identificación más alto se produjo durante el mes de diciembre, con un 100, 100
y 53 % de detección para las variedades Limonera,
Barlett y Blanquilla respectivamente (Gráfico
2). Para la variedad Limonera la detección también
fue del 100% los meses de Enero y Febrero, mientras que en la variedad Blanquilla la detección fue en general baja siendo los
meses con mayor porcentaje de detección julio y diciembre (Gráfico 2).
En cuanto a la parte estructural del árbol, donde mejor se
detecta el fitoplasma es en la corteza, seguido de las yemas. En los nervios de
las hojas es donde menos se detecta al contrario de lo que ocurre en otras
especies vegetales como viña (Gráfico 3).
4.2.-Evaluación de la susceptibilidad y resistencia del
material vegetal. Influencia de la combinación patrón-variedad en el desarrollo
de los síntomas.
Actividad 10.- Seguimiento de la expresión de síntomas a lo largo del año
en árboles afectados de las variedades Blanquilla injertada en peral franco,
Blanquilla injertada en membrillero, Limonera injertada en peral franco y
Barlett injertada en peral franco.
Esté ensayo se realizó con los mismos 45 árboles utilizados en la
actividad anterior y consistió en anotar mensualmente los síntomas observados en
los quince árboles de cada variedad.
La sintomatología asociada al PD era patente ya en el mes de mayo en un
46, 40 y 60% de los árboles observados de las variedades Barlett, Limonera y Blanquilla respectivamente, aunque fue en noviembre
cuando estos fueron más acusados, con el 100% de los árboles presentando
síntomas (Gráfico 4).
Los síntomas varían según el tipo de variedad, así en Barlett los síntomas más característicos fueron
clorosis, manchas necróticas y enrojecimiento prematuro; en Limonera clorosis, manchas necróticas y disminución del
crecimiento y por ultimo en Blanquilla, clorosis y
disminución del crecimiento en los meses de mayo y septiembre.
Actividad 11.- Ensayo realizado con cinco patrones ( C.oblonga BA-29, C.oblonga
MA, C. oblonga Adams, Pyrus
communis y P. communis OHF-333) y cuatro
variedades (Blanquilla, Conference, Mantecosa Bosc y
Decana del congreso).
Los ensayos se encuentran en curso y consisten en valorar
la susceptibilidad a la infección de cinco patrones injertados con cuatro
variedades (20 combinaciones). Este ensayo se inicio hace un año y se requieren
dos años más de observaciones para disponer de resultados concluyentes.
El conocimiento de estos resultados es muy importante para
decidir los patrones y variedades más adecuados a utilizar en una zona donde la
enfermedad y el vector están presentes y por tanto es muy difícil su
erradicación. La utilización del material vegetal más tolerante a la enfermedad
junto con un control adecuado del vector y un control sanitario riguroso del
material de nueva plantación, son por ahora los únicos métodos para que los
daños producidos por la enfermedad sean pocos.
5.- APLICACIÓN AL SECTOR Y POSIBLE DIFUSIÓN DE
RESULTADOS
La prospección realizada para conocer la incidencia real del fitoplama
asociado al decaimiento del peral ha permitido conocer la importancia de la
enfermedad y su participación en una sintomatología que muchas veces se atribuía
erróneamente a otras causas. El conocimiento de la distinta expresión de
síntomas de esta enfermedad ha permitido que los técnicos puedan identificar
la enfermedad en las distintas épocas del año y en las distintas variedades y
patrones.
La identificación del fitoplasma durante el invierno ha mostrado el
peligro de propagar la enfermedad a través de yemas tomadas durante este
período.
Los estudios de detección a lo largo del año y en distintos tejidos y
órganos han mostrado cual era el mejor momento para identificar la enfermedad
con la máxima fiabilidad y como y de donde se debían tomar las muestras. Estos
datos han sido difundidos entre técnicos y productores que envían muestras a
distintos laboratorios para ser analizadas.
Se ha confirmado que la observación visual de síntomas es insuficiente
para el control del material vegetal en viveros, ya que el fitoplasma esta
presente mucho antes de la aparición de síntomas.
Se ha confirmado que Cacopsylla pyri era el
principal vector de la enfermedad en nuestro país y se ha determinado el
porcentaje de individuos infectados de esta especie a lo largo del año en tres
parcelas afectadas.
Se han determinado las mejores condiciones para el análisis del PD mediante PCR, evaluando iniciadores, métodos de
extracción de ADN y modalidades de lectura de resultados.
Los resultados obtenidos han sido difundidos mediante publicaciones
científicas y de divulgación. Algunas publicaciones se encuentran todavía en
preparación como las concernientes a la evolución y distribución del fitoplasma
en el árbol, cuantificación del fitoplasma en las distintas partes del mismo,
mejora de técnicas de diagnostico, valoración de la susceptibilidad al
fitoplasma de distintas combinaciones patrón-variedad, etc.
También se han mantenido reuniones anuales con los técnicos de las
Asociaciones para Defensa de los vegetales y con el sector.
Así mismo se han mantenido informados de los resultados a todas las
entidades y empresas que han colaborado en el proyecto.
6.- COLABORACIONES Y AYUDAS PRESTADAS
Se ha contado con la colaboración de los técnicos de las
Asociaciones de Defensa Vegetal de Lérida y Gerona, los cuales han participado
activamente en la realización de las prospecciones, localizando las parcelas
afectadas y realizando la toma de muestras en algunos casos.
También se ha contado con la ayuda de distintas empresas
como CERTIPLANT, INVITRO SA Y AGROMILLORA CATALANA SA, las cuales han
suministrado el material vegetal para los ensayos de susceptibilidad o
resistencia al Pear decline.
Se contó con una beca predoctoral de la CIRIT (Comisió
Interdepartamental de Recerca i Tecnología) con la cual se incorporó al proyecto
un becario, Meritxell García Chapa, para realizar su tesis doctoral en uno de los
objetivos del proyecto (Mejora de técnicas de diagnostico y variabilidad
genética del fitoplasma). Este becario se incorporó el último año de proyecto y
sigue su tesis en el proyecto que se ha iniciado este año.
7.- VINCULACIÓN DEL PROYECTO A PROGRAMAS DE COOPERACIÓN
CIENTÍFICA TÉCNICA INTERNACIONAL: ENTIDADES EXTRANJERAS CON LAS QUE SE HA
COOPERADO, FINANCIACIÓN Y CUANTIA EN SU CASO Y UTILIZACIÓN DE LOS RESULTADOS
ALCANZADOS.
Se ha tenido una cooperación bilateral con Alemania para el estudio de
especies de insectos transmisores del fitoplasma del stolbur. Esta cooperación
nos permitió incorporar una visita al Institut fuer Pflanzenschutz im Obstbau de Dossenheim
(Alemania) e iniciar una colaboración con el Dr. Seemüller de este Instituto. Esta colaboración consistirá
principalmente en la caracterización molecular de aislados de Pear decline procedentes de Alemania y España.
El coordinador del proyecto tuvo una beca CIRIT en 1997 de un mes de
duración para una estancia con el grupo de fitoplasmas dirigido por el Dr. Bruce
Kirkpatrick de la Universidad de Davis (California).
Durante el proyecto hemos asistido a dos reuniones del grupo de
investigadores que trabajan en fitoplasmas La primera fue en 1998 y tuvo lugar
en Sydney, el tema de trabajo de esta reunión fue acordar puntos para establecer
unas claves adecuadas para la taxonomía de los fitoplasmas. La segunda fue
convocada por el Dr. Bové y tuvo lugar en diciembre de 1999 en el INRA de
Burdeos, la finalidad de la misma era preparar dos proyectos para ser
presentados a la CEE, uno de caracterización molecular de fitoplasmas y otro de
epidemiología de fitoplasmas.
A través de un acuerdo de cooperación Ibero Americana de la Universidad
de Lérida se tuvo un becario (Omar Giovanni Rodríguez) que realizó su proyecto
final de carrera, llevando a cabo uno de los objetivos del proyecto (Detección
del fitoplasma del Pear decline en distintos niveles del árbol).