CRISPR/Cas9: una nueva herramienta para la modificación del gen de PTEN mediante RNA-guía

Abstract

CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR associated system) es un sistema de edición genómica que utiliza una endonucleasa derivada de la Cas9 bacteriana para introducir roturas de doble cadena en el DNA en lugares precisos del genoma usando un RNA guía complementario a la región diana. En este trabajo, se intenta desarrollar un knock-in en la línea celular HEK-293T, en donde la inserción del gen que codifica para la proteína de resistencia a la puromicina es producida por la recombinación homóloga directa (HDR) mediada por la Cas9 en el exón/intrón 1 del gen PTEN. PTEN (también conocido como MMAC1 o TEP1) codifica para una fostatasa dual de lípidos y de proteínas la cual actúa como supresor tumoral. Esta antagoniza la actividad de la PI3K defosforilando el fofatidilinositol (3,4,5)-trifosfato (PIP3) a fosfatidilinositol (4,5)-bifosfato (PIP2). Usando este enfoque, comparamos dos estrategias para la creación de los brazos de homología a partir de los cuales se producirá la HDR, centrándonos en la variación de la longitud de estos brazos. Finalmente, obtuvimos una línea celular HEK-293T en la que la expresión del gen PTEN estaba suprimida y la vía PI3K/Akt/mTOR alterada. Concluimos que en nuestro caso, el sistema CRISPR/Cas tiene una mayor eficiencia y eficacia al usar los brazos de homología largos.

CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR associated system) is a genome-editing system that makes use of the bacterially-derived endonuclease Cas9 to introduce DNA double-strand breaks (DSB) at precise locations in the genome using complementary guide RNAs. In this job, we tried to develop a knock-in, whereby the insertion of a gene encoding the puromycin resistance protein is inserted by Cas9-mediated homology directed repair (HDR) within the first exon/intron of PTEN gene in a HEK-293T cell line. PTEN (also named MMAC1 or TEP1) encodes a dual lipid and protein phosphatase which acts as a tumor suppressor. It antagonizes the PI3K activity by dephosphorylating phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3) to phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PIP2). Using this approach, we compared two strategies for create the homology arms, from which it is going to happen the HDR, focusing on the variety of the length of this homology arms. Ultimately, we got a HEK-293T cell line which PTEN expresion was delated and the PI3K/Akt/mTOR pathway was altered. We concluded that with the long homology arms we have more efficiency and effectiveness in the CRISPR/Cas system.