Expressió, purificació i cristal·lització de la proteïna HMGA1a humana amb oligonucleòtids rics en ATs

Abstract

En tota mena de càncers es troben altes concentracions de proteïnes HMGA. Per comprendre el mecanisme d’acció d'aquestes proteïnes cal determinar l’estructura tridimensional dels complexos d’aquestes amb el DNA. Amb aquesta finalitat en aquest projecte es persegueix l’obtenció de co-cristalls de la proteïna HMGA1a i els seus fragments amb oligonucleòtids sintètics rics en seqüències ATs i també provar la cristal·lització d’un pèptid sintètic amb una seqüència similar a la proteïna amb aquests mateixos oligonucleòtids. En primer lloc, s’han obtingut la proteïna HMGA1a humana (i els seus fragments) a partir de la seva expressió en un cultiu bacterià d’Escherichia coli utilitzant la tecnologia del DNA recombinant. Posteriorment s’ha purificat aquesta proteïna fins al grau adient pels experiments de cristal·lografia. Aquesta purificació s’ha realitzat amb cromatografies de bescanvi catiònic i s’ha estudiat quines són les condicions més òptimes per a l’obtenció de la proteïna HMGA1a. En una segona etapa, a partir dels complexos DNA-proteïna, hem obtingut cristalls mitjançant la tècnica de difusió de vapor amb gota penjada. Els cristalls han estat difractats amb raigs X a les instal·lacions del sincrotró de Grenoble ESRF. Amb l’estudi de les intensitats de les reflexions hem intentat resoldre l'estructura molecular pel mètode del reemplaçament molecular. Finalment hem trobat els paràmetres de cel·la, el grup espacial i l’empaquetament de dues seqüències d’oligonucleòtids. També en tots dos casos hem arribat a un model estructural aproximat de les cadenes de DNA en l’espai però en cap d’ells s’aprecia clarament la presència de la part proteica.